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新品發(fā)布丨華納生物寡核苷酸合成試劑上新啦!

發(fā)布日期:2024-04-30 瀏覽次數(shù):1469


合肥華納隆重推出寡核苷酸合成試劑,包括各種配方的脫保護(hù)劑、活化劑、加帽劑、氧化劑以及符合標(biāo)準(zhǔn)含水量的乙腈。能滿足用戶在藥物基因組學(xué)、診斷方法和藥物開發(fā)等應(yīng)用方面的需求,廣泛用于實(shí)驗(yàn)室及批量生產(chǎn)規(guī)模的DNA/RNA 合成。歡迎新老客戶咨詢!

寡核苷酸合成試劑知多少

固相合成方法自1987年被Marvin H. Ca ruthers發(fā)明之后,因其具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)及醫(yī)藥研究等領(lǐng)域,目前已成為一項(xiàng)較為成熟的寡核苷酸合成方法。

不同于酶促反應(yīng)從5'端→3'端方向延伸的合成過程,固相亞磷酰胺法合成是由3'端開始。在合成過程中除合成柱、核苷單體外,還需要用到合成輔助試劑:如脫保護(hù)劑、活化劑、加帽劑等等。今天我們一起來了解,在每一步反應(yīng)中合成試劑的種類及作用。

一、脫保護(hù)(Deblocking)反應(yīng)

脫保護(hù)反應(yīng)中使用三氯乙酸(TCA)去除核苷5'端位置上的 DMT保護(hù)基團(tuán),從而在5'端產(chǎn)生活性基團(tuán)(-OH),以便于進(jìn)行后續(xù)的偶聯(lián)反應(yīng)。

圖1. 脫保護(hù)過程示意圖

此步驟中會使用到脫保護(hù)試劑:二氯乙酸或三氯乙酸/二氯甲烷,二氯甲烷作為溶劑存在,二氯乙酸或三氯乙酸的濃度為3%,與核苷作用,使其產(chǎn)生活性基團(tuán)(-OH)用于下一步偶聯(lián)反應(yīng)。脫保護(hù)反應(yīng)完成后,使用乙腈洗滌去除殘留的脫保護(hù)劑,以防止脫保護(hù)劑殘留產(chǎn)生雜質(zhì)。

二、偶聯(lián)(Coupling)反應(yīng)

偶聯(lián)反應(yīng)發(fā)生之前,需先將下一個亞磷酰胺單體與四氮唑(催化劑)混合后置入合成柱,四氮唑的作用是將3'端磷酸基團(tuán)位置上的二異丙胺基質(zhì)子化,也稱為活化。隨后,脫保護(hù)反應(yīng)中產(chǎn)生的活性基團(tuán)(-OH)會與活化后的四唑中間體結(jié)合,形成新的磷氧鍵,并脫去四唑。

圖2. 偶聯(lián)過程示意圖

此步驟中會使用到活化劑:5-乙?guī)€基四氮唑/乙腈。四氮唑的作用是與核酸的亞磷酰胺單體反應(yīng)生成活性中間體。

三、加帽(Capping)反應(yīng)

加帽主要是為了防止未參與上一階段循環(huán)的活性基團(tuán)(-OH)在新的循環(huán)中與新加入的亞磷酰胺單體發(fā)生偶聯(lián),產(chǎn)生短鏈雜質(zhì)。此步驟之前常使用加帽劑對未參與反應(yīng)的活性基團(tuán)(-OH)進(jìn)行端口封閉,避免其干擾下一輪循環(huán)。反應(yīng)過程十分迅速,通常幾秒即可(這是因?yàn)樾枰用钡幕钚曰鶊F(tuán)(-OH)比較少,乙酰化試劑的活性高且過量)。太長的加帽時間會增加在非預(yù)期位置發(fā)生乙?;磻?yīng)的可能性,增加乙酸酐與水形成酸攻擊新生成的亞磷酯鍵的危險性。

圖3. 加帽過程示意圖

此步驟中會使用到加帽劑,加帽劑分為2種,使用之前分開存放。加帽試劑A(CapA),為醋酸酐;加帽試劑B(CapB)為N-甲基咪唑,作為?;磻?yīng)的催化劑。二者混合后會形成活性很強(qiáng)的活性試劑。

四、氧化(Oxidizing)反應(yīng)

偶聯(lián)之后新的核苷酸通過亞磷酯鍵與寡核苷酸鏈相連,亞磷酯鍵不穩(wěn)定且易被酸堿水解破壞,因此需要被氧化成穩(wěn)定的五價的磷。被氧化后的磷酸二酯鍵在原有的磷酸二酯鍵外會多出一個2-氰乙基保護(hù),使得其在后續(xù)的延伸過程中更加穩(wěn)定。氧化過程通常采用碘的四氫呋喃溶液作為氧化劑,氧化結(jié)束后,延伸得到的寡核苷酸鏈繼續(xù)進(jìn)行下一輪循環(huán),直至鏈延伸至所需的長度。

圖4. 氧化過程示意圖

注:圖1-4合成過程參考文獻(xiàn):Large-scale de novo DNA synthesis: technologies and applications.

氧化反應(yīng)步驟中會使用到氧化劑,常用的氧化劑為碘的四氫呋喃和吡啶、水的混合溶液,作用是將亞磷酰胺中間體轉(zhuǎn)化為磷酸三酯,得到穩(wěn)定的寡核苷酸。

當(dāng)寡核苷酸鏈經(jīng)過以上四個步驟的多次循環(huán)達(dá)到所需的長度時,將合成的寡核苷酸鏈從固相載體上切割下來,之后仍需對其進(jìn)行純化方能獲得成品。

在上述合成反應(yīng)中用到合成試劑需經(jīng)過特殊的純化工藝,滿足含水量、純度等技術(shù)指標(biāo),確保優(yōu)異的合成效率。所有的合成試劑也都要經(jīng)過嚴(yán)格的過濾,減少固體微粒的污染。在合成過程中選擇高品質(zhì)的合成試劑,也是寡核苷酸合成過程中高純度和高耦合效率的保障之一。

關(guān)于華納生物

合肥華納生物醫(yī)藥科技有限公司成立于2017年,致力于提供修飾性核苷、核苷酸、亞磷酰胺基因單體和熒光染料系列有關(guān)產(chǎn)品的研產(chǎn)銷一體化解決方案。公司在合肥循環(huán)經(jīng)濟(jì)示范園建立了GMP標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)代化生產(chǎn)基地。已經(jīng)通過多家國內(nèi)外頭部企業(yè)的審計(jì)檢查??梢愿哔|(zhì)量長期穩(wěn)定供應(yīng)噸級產(chǎn)品,確??蛻艄?yīng)鏈安全。


合肥華納隆重推出寡核苷酸合成試劑,包括各種配方的脫保護(hù)劑、活化劑、加帽劑、氧化劑以及符合標(biāo)準(zhǔn)含水量的乙腈。能滿足用戶在藥物基因組學(xué)、診斷方法和藥物開發(fā)等應(yīng)用方面的需求,廣泛用于實(shí)驗(yàn)室及批量生產(chǎn)規(guī)模的DNA/RNA 合成。歡迎新老客戶咨詢!

寡核苷酸合成試劑知多少

固相合成方法自1987年被Marvin H. Ca ruthers發(fā)明之后,因其具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)及醫(yī)藥研究等領(lǐng)域,目前已成為一項(xiàng)較為成熟的寡核苷酸合成方法。

不同于酶促反應(yīng)從5'端→3'端方向延伸的合成過程,固相亞磷酰胺法合成是由3'端開始。在合成過程中除合成柱、核苷單體外,還需要用到合成輔助試劑:如脫保護(hù)劑、活化劑、加帽劑等等。今天我們一起來了解,在每一步反應(yīng)中合成試劑的種類及作用。

一、脫保護(hù)(Deblocking)反應(yīng)

脫保護(hù)反應(yīng)中使用三氯乙酸(TCA)去除核苷5'端位置上的 DMT保護(hù)基團(tuán),從而在5'端產(chǎn)生活性基團(tuán)(-OH),以便于進(jìn)行后續(xù)的偶聯(lián)反應(yīng)。

圖1. 脫保護(hù)過程示意圖

此步驟中會使用到脫保護(hù)試劑:二氯乙酸或三氯乙酸/二氯甲烷,二氯甲烷作為溶劑存在,二氯乙酸或三氯乙酸的濃度為3%,與核苷作用,使其產(chǎn)生活性基團(tuán)(-OH)用于下一步偶聯(lián)反應(yīng)。脫保護(hù)反應(yīng)完成后,使用乙腈洗滌去除殘留的脫保護(hù)劑,以防止脫保護(hù)劑殘留產(chǎn)生雜質(zhì)。

二、偶聯(lián)(Coupling)反應(yīng)

偶聯(lián)反應(yīng)發(fā)生之前,需先將下一個亞磷酰胺單體與四氮唑(催化劑)混合后置入合成柱,四氮唑的作用是將3'端磷酸基團(tuán)位置上的二異丙胺基質(zhì)子化,也稱為活化。隨后,脫保護(hù)反應(yīng)中產(chǎn)生的活性基團(tuán)(-OH)會與活化后的四唑中間體結(jié)合,形成新的磷氧鍵,并脫去四唑。

圖2. 偶聯(lián)過程示意圖

此步驟中會使用到活化劑:5-乙?guī)€基四氮唑/乙腈。四氮唑的作用是與核酸的亞磷酰胺單體反應(yīng)生成活性中間體。

三、加帽(Capping)反應(yīng)

加帽主要是為了防止未參與上一階段循環(huán)的活性基團(tuán)(-OH)在新的循環(huán)中與新加入的亞磷酰胺單體發(fā)生偶聯(lián),產(chǎn)生短鏈雜質(zhì)。此步驟之前常使用加帽劑對未參與反應(yīng)的活性基團(tuán)(-OH)進(jìn)行端口封閉,避免其干擾下一輪循環(huán)。反應(yīng)過程十分迅速,通常幾秒即可(這是因?yàn)樾枰用钡幕钚曰鶊F(tuán)(-OH)比較少,乙?;噭┑幕钚愿咔疫^量)。太長的加帽時間會增加在非預(yù)期位置發(fā)生乙?;磻?yīng)的可能性,增加乙酸酐與水形成酸攻擊新生成的亞磷酯鍵的危險性。

圖3. 加帽過程示意圖

此步驟中會使用到加帽劑,加帽劑分為2種,使用之前分開存放。加帽試劑A(CapA),為醋酸酐;加帽試劑B(CapB)為N-甲基咪唑,作為?;磻?yīng)的催化劑。二者混合后會形成活性很強(qiáng)的活性試劑。

四、氧化(Oxidizing)反應(yīng)

偶聯(lián)之后新的核苷酸通過亞磷酯鍵與寡核苷酸鏈相連,亞磷酯鍵不穩(wěn)定且易被酸堿水解破壞,因此需要被氧化成穩(wěn)定的五價的磷。被氧化后的磷酸二酯鍵在原有的磷酸二酯鍵外會多出一個2-氰乙基保護(hù),使得其在后續(xù)的延伸過程中更加穩(wěn)定。氧化過程通常采用碘的四氫呋喃溶液作為氧化劑,氧化結(jié)束后,延伸得到的寡核苷酸鏈繼續(xù)進(jìn)行下一輪循環(huán),直至鏈延伸至所需的長度。

圖4. 氧化過程示意圖

注:圖1-4合成過程參考文獻(xiàn):Large-scale de novo DNA synthesis: technologies and applications.

氧化反應(yīng)步驟中會使用到氧化劑,常用的氧化劑為碘的四氫呋喃和吡啶、水的混合溶液,作用是將亞磷酰胺中間體轉(zhuǎn)化為磷酸三酯,得到穩(wěn)定的寡核苷酸。

當(dāng)寡核苷酸鏈經(jīng)過以上四個步驟的多次循環(huán)達(dá)到所需的長度時,將合成的寡核苷酸鏈從固相載體上切割下來,之后仍需對其進(jìn)行純化方能獲得成品。

在上述合成反應(yīng)中用到合成試劑需經(jīng)過特殊的純化工藝,滿足含水量、純度等技術(shù)指標(biāo),確保優(yōu)異的合成效率。所有的合成試劑也都要經(jīng)過嚴(yán)格的過濾,減少固體微粒的污染。在合成過程中選擇高品質(zhì)的合成試劑,也是寡核苷酸合成過程中高純度和高耦合效率的保障之一。

關(guān)于華納生物

合肥華納生物醫(yī)藥科技有限公司成立于2017年,致力于提供修飾性核苷、核苷酸、亞磷酰胺基因單體和熒光染料系列有關(guān)產(chǎn)品的研產(chǎn)銷一體化解決方案。公司在合肥循環(huán)經(jīng)濟(jì)示范園建立了GMP標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)代化生產(chǎn)基地。已經(jīng)通過多家國內(nèi)外頭部企業(yè)的審計(jì)檢查??梢愿哔|(zhì)量長期穩(wěn)定供應(yīng)噸級產(chǎn)品,確??蛻艄?yīng)鏈安全。

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