合肥華納隆重推出寡核苷酸合成試劑，包括各種配方的脫保護劑、活化劑、加帽劑、氧化劑以及符合標準含水量的乙腈。能滿足用戶在藥物基因組學、診斷方法和藥物開發(fā)等應用方面的需求，廣泛用于實驗室及批量生產(chǎn)規(guī)模的DNA/RNA 合成。歡迎新老客戶咨詢！

寡核苷酸合成試劑知多少

固相合成方法自1987年被Marvin H. Ca ruthers發(fā)明之后，因其具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應物比較穩(wěn)定的特點，被廣泛應用于分子生物學及醫(yī)藥研究等領域，目前已成為一項較為成熟的寡核苷酸合成方法。

不同于酶促反應從5'端→3'端方向延伸的合成過程，固相亞磷酰胺法合成是由3'端開始。在合成過程中除合成柱、核苷單體外，還需要用到合成輔助試劑：如脫保護劑、活化劑、加帽劑等等。今天我們一起來了解，在每一步反應中合成試劑的種類及作用。

一、脫保護（Deblocking）反應

脫保護反應中使用三氯乙酸（TCA）去除核苷5'端位置上的 DMT保護基團，從而在5'端產(chǎn)生活性基團（-OH），以便于進行后續(xù)的偶聯(lián)反應。

圖1. 脫保護過程示意圖

此步驟中會使用到脫保護試劑：二氯乙酸或三氯乙酸/二氯甲烷，二氯甲烷作為溶劑存在，二氯乙酸或三氯乙酸的濃度為3%，與核苷作用，使其產(chǎn)生活性基團（-OH）用于下一步偶聯(lián)反應。脫保護反應完成后，使用乙腈洗滌去除殘留的脫保護劑，以防止脫保護劑殘留產(chǎn)生雜質。

二、偶聯(lián)（Coupling）反應

偶聯(lián)反應發(fā)生之前，需先將下一個亞磷酰胺單體與四氮唑（催化劑）混合后置入合成柱，四氮唑的作用是將3'端磷酸基團位置上的二異丙胺基質子化，也稱為活化。隨后，脫保護反應中產(chǎn)生的活性基團（-OH）會與活化后的四唑中間體結合，形成新的磷氧鍵，并脫去四唑。

圖2. 偶聯(lián)過程示意圖

此步驟中會使用到活化劑：5-乙?guī)€基四氮唑/乙腈。四氮唑的作用是與核酸的亞磷酰胺單體反應生成活性中間體。

三、加帽（Capping）反應

加帽主要是為了防止未參與上一階段循環(huán)的活性基團（-OH）在新的循環(huán)中與新加入的亞磷酰胺單體發(fā)生偶聯(lián)，產(chǎn)生短鏈雜質。此步驟之前常使用加帽劑對未參與反應的活性基團（-OH）進行端口封閉，避免其干擾下一輪循環(huán)。反應過程十分迅速，通常幾秒即可（這是因為需要加帽的活性基團（-OH）比較少，乙?；噭┑幕钚愿咔疫^量）。太長的加帽時間會增加在非預期位置發(fā)生乙?；磻目赡苄?，增加乙酸酐與水形成酸攻擊新生成的亞磷酯鍵的危險性。

圖3. 加帽過程示意圖

此步驟中會使用到加帽劑，加帽劑分為2種，使用之前分開存放。加帽試劑A（CapA），為醋酸酐；加帽試劑B（CapB）為N-甲基咪唑，作為?；磻拇呋瘎?。二者混合后會形成活性很強的活性試劑。

四、氧化（Oxidizing）反應

偶聯(lián)之后新的核苷酸通過亞磷酯鍵與寡核苷酸鏈相連，亞磷酯鍵不穩(wěn)定且易被酸堿水解破壞，因此需要被氧化成穩(wěn)定的五價的磷。被氧化后的磷酸二酯鍵在原有的磷酸二酯鍵外會多出一個2-氰乙基保護，使得其在后續(xù)的延伸過程中更加穩(wěn)定。氧化過程通常采用碘的四氫呋喃溶液作為氧化劑，氧化結束后，延伸得到的寡核苷酸鏈繼續(xù)進行下一輪循環(huán)，直至鏈延伸至所需的長度。

圖4. 氧化過程示意圖

注：圖1-4合成過程參考文獻：Large-scale de novo DNA synthesis: technologies and applications.

氧化反應步驟中會使用到氧化劑，常用的氧化劑為碘的四氫呋喃和吡啶、水的混合溶液，作用是將亞磷酰胺中間體轉化為磷酸三酯，得到穩(wěn)定的寡核苷酸。

當寡核苷酸鏈經(jīng)過以上四個步驟的多次循環(huán)達到所需的長度時，將合成的寡核苷酸鏈從固相載體上切割下來，之后仍需對其進行純化方能獲得成品。

在上述合成反應中用到合成試劑需經(jīng)過特殊的純化工藝，滿足含水量、純度等技術指標，確保優(yōu)異的合成效率。所有的合成試劑也都要經(jīng)過嚴格的過濾，減少固體微粒的污染。在合成過程中選擇高品質的合成試劑，也是寡核苷酸合成過程中高純度和高耦合效率的保障之一。

關于華納生物

合肥華納生物醫(yī)藥科技有限公司成立于2017年，致力于提供修飾性核苷、核苷酸、亞磷酰胺基因單體和熒光染料系列有關產(chǎn)品的研產(chǎn)銷一體化解決方案。公司在合肥循環(huán)經(jīng)濟示范園建立了GMP標準現(xiàn)代化生產(chǎn)基地。已經(jīng)通過多家國內外頭部企業(yè)的審計檢查。可以高質量長期穩(wěn)定供應噸級產(chǎn)品，確保客戶供應鏈安全。